MICROBIOLOGIA – COLORACIONES

GRAM:

•    Preparar un extendido fino del material a colorear y dejar secar al aire.
•    Fijar al calor, pasando el preparado 3 o 4 veces dentro de la llama del mechero bunsen.
•    Cubrir el portaobjeto con cristal violeta durante 1 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
•    Cubrir el portaobjeto con solución de lugol  durante 1 a 2 min. y lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
•    Sostener el porta-objetos entre el dedo pulgar e índice y decolorar con alcohol-acetona. (10 seg.) La decoloración es el paso más crítico del procedimiento de esta técnica. la tendencia a sobredecolorar hace que bacterias Gram positivas aparezcan Gram negativas.
•    Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua corriente para remover el alcohol-acetona y frenar la decoloración. Eliminar el exceso de agua.
•    Cubrir el frotis con solución de fucsina o safranina durante 30 – 60 seg. Lavar con agua corriente.
•    Control:     Gram positivo: Staphylococcus aureus
Gram negativo: Escherchia coli

Reactivos:
–    Solución 1:  sol. madre de cristal violeta. Disolver 10 grs. de colorante en 100ml de alcohol 95%. Guardar en botella de vidrio durante un año.
–    Solución de trabajo: filtrar 10 ml de la solución madre y agregar 40 ml de solución recién filtrada de oxalato de sodio al 1% o de H2O dest.
–    Lugol: Disolver 25 gr de Iodo cristalino + 50 g IK + 500 ml H2O dest. Guardar botella color caramelo.
–    Decolorante: Partes iguales de etanol 95% y acetona. Guardar frasco color caramelo a TA (temperatura ambiente).
–    Contracolorante:
a)    Safranina: tomar 20 ml de solución de safranina al 2,5 % en etanol 95% y agregar 180 ml de H2O dest.
b)    Fucsina básica: disolver 0,1 o o,2 g de fucsina básica en 100 ml de H2O dest. Guardar en botella oscura durante un año.

GRAM WEIGERT

Recomendado para observar quistes de Pneumocystis carinii.

•    Fijar con metanol tres minutos.
•    Cubrir con eosina amarilla durante 5 minutos.
•    Lavar con  agua y añadir cristal violeta recién filtrado. Dejar 3 min.
•    Lavar con solución de Iodo y dejar con esta misma 5 minutos.
•    Lavar con agua, secar cuidadosamente con papel, tanto la parte superior como la inferior del porta-objetos y dejar secar al aire.
•    Decolorar con anilina- xileno hasta que no desprenda más color púrpura ( el extendido debe quedar color rosado ).
•    Enjuagar con xileno, secar al aire y observar con inmersión.

Los quistes de P. carinii y hongos se tiñen de azul oscuro e irregularmnete. Los núcleos celulares pueden teñirse de azul si no están bien decolorados, pero no son tan oscuros como los quistes de P. carinii.

Reactivos:
–    Eosina: Disolver 1g de eosina amarilla en 100 ml de agua dest.
–    Cristal violeta: mezclar soloc. A y B . Filtrar antes de usar. Estable por tres meses.
–    Solución A: mezclar 2 ml de anilina con 88 ml de agua dest. Filtrar
–    Solución B: disolver 5 g de cristal violeta en 10 ml de etanol al 95%.
–    Solución de Iodo: 2g de IK + pequeña cantidad de agua dest. Agregar 1 g de iodo y llevar a 300 ml con agua dest.
–    Anilina-xileno: mezclar partes iguales de los 2 reactivos.

ZIEHL NEELSEN

•    Fijar el extendido por calor
•    Cubrir el preparado con sol. de fucsina y calentar el preparado hasta desprendimiento de humos blancos, durante 5 min. Agregar agua si el preparado comienza a desecarse.
•    Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido .
•    Lavar con agua y contracolorear con azul de metileno durante 1 min.
•    Lavar y secar al aire. Mirar a 100x.

Reactivos:
–    Fucsina:
a)    Disolver 3g de fucsina en 10 ml al 95%
b)    Disolver 5g  de fenol cristalizado en 100 ml .
c)    Mezclar 10 ml de soluc. A con 90 ml de soluc. B y guardar a temp. ambiente durante 3 meses.
–    Alcohol ácido: 3ml de HCL + 97 ml de “ ol “ al 95%.
–    Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml agua dest.

TINTA CHINA

•    Mezclar una gota de LCR con una gota de tinta china (Pelikan) o nigrosina, sobre un portaobjetos. Si la tinta china está muy concentrada diluir con agua destilada.
•    Colocar un cubreobjetos y observar antes que se seque con objetivo de 40 o 100x.
•    Permite observar con claridad microorganismos rodeados de cápsula ( por ej. Cryptococcus neoformans ).

KINYOUN

•    Fijar los extendidos con metanol.
•    Cubrir con carbolfucsina durante 5 min. + calor hasta vapores blancos una vez.
•    Lavar con agua.  Decolorar con H2SO4  5% 30 – 60 segundos.
•    Lavar con agua. Escurrir. Agregar azul de metileno 3 min.
•    Lavar secar. Observar a 100x.
•    Permite observar Cryptosporidium parvum e Isospora belli ( color rojo a rosado ).

Reactivos
–    Solución A:  0,3 g de fucsina + 10 ml de etanol al 95%
–    Solución B: 5g de fenol + 100 ml de agua dest. Calentar hasta disolución.
–    Mezclar A y B. Conservar a temp amb. Estable 1 año.
–    Decolorante: 5 ml  H2SO4  (c) + 95 ml de agua destilada
–    Azul de metileno: 0,3g de azul de metileno + 100 ml de agua dest.

3 comentarios »

  1. Nataly jimenez said

    me parece una pagina interesante , aunque falta contenido en la parte de coloraciones , si tienen informacion interesante envienmela al correo

  2. jose said

    esta interresante pero quiero una separata sobre coloraciones de microrganismo si puede enviarlo a mi correo

  3. Cecilia said

    me encanta esta materia,me podrian mandar mas informacion a mi correo? gracia

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